Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Poleg tega, da zagotovimo stalno podporo, spletno mesto prikažemo brez slogov in JavaScripta.
Prikaže vrtiljak treh diapozitivov hkrati.Uporabite gumba Prejšnji in Naslednji, da se premikate po treh diapozitivih hkrati, ali pa uporabite gumbe drsnika na koncu, da se premikate skozi tri diapozitive hkrati.
Z razvojem novih ultra mehkih materialov za medicinske pripomočke in biomedicinske aplikacije je celovita karakterizacija njihovih fizikalnih in mehanskih lastnosti pomembna in zahtevna.Uporabljena je bila modificirana tehnika nanoindentiranja z mikroskopijo na atomsko silo (AFM) za karakterizacijo izjemno nizkega površinskega modula nove biomimetične kontaktne leče iz silikonskega hidrogela lehfilcon A, prevlečene s plastjo razvejanih polimernih krtačnih struktur.Ta metoda omogoča natančno določanje kontaktnih točk brez učinkov viskoznega iztiskanja pri približevanju razvejanim polimerom.Poleg tega omogoča določanje mehanskih lastnosti posameznih krtačnih elementov brez učinka poroelastičnosti.To dosežemo z izbiro sonde AFM z zasnovo (velikost konice, geometrija in stopnja vzmeti), ki je posebej primerna za merjenje lastnosti mehkih materialov in bioloških vzorcev.Ta metoda izboljšuje občutljivost in natančnost za natančno merjenje zelo mehkega materiala lehfilcon A, ki ima izjemno nizek modul elastičnosti na površini (do 2 kPa) in izjemno visoko elastičnost v notranjem (skoraj 100 %) vodnem okolju. .Rezultati površinske študije niso le razkrili izjemno mehkih površinskih lastnosti leče lehfilcon A, ampak so tudi pokazali, da je modul razvejanih polimernih ščetk primerljiv z modulom silicijevega vodikovega substrata.To tehniko površinske karakterizacije je mogoče uporabiti za druge ultra mehke materiale in medicinske pripomočke.
Mehanske lastnosti materialov, namenjenih neposrednemu stiku z živim tkivom, so pogosto določene z biološkim okoljem.Popolno ujemanje teh lastnosti materiala pomaga doseči želene klinične značilnosti materiala brez povzročanja neželenih celičnih odzivov1,2,3.Za homogene materiale v razsutem stanju je karakterizacija mehanskih lastnosti razmeroma enostavna zaradi razpoložljivosti standardnih postopkov in preskusnih metod (npr. mikroindentiranje4,5,6).Vendar za ultra mehke materiale, kot so geli, hidrogeli, biopolimeri, žive celice itd., te preskusne metode na splošno niso uporabne zaradi omejitev merilne ločljivosti in nehomogenosti nekaterih materialov7.Z leti so bile tradicionalne metode zarezovanja spremenjene in prilagojene za karakterizacijo širokega spektra mehkih materialov, vendar ima veliko metod še vedno resne pomanjkljivosti, ki omejujejo njihovo uporabo8,9,10,11,12,13.Pomanjkanje specializiranih preskusnih metod, ki bi lahko natančno in zanesljivo opredelile mehanske lastnosti supermehkih materialov in površinskih plasti, močno omejuje njihovo uporabo v različnih aplikacijah.
V našem prejšnjem delu smo predstavili kontaktno lečo lehfilcon A (CL), mehak heterogeni material z vsemi ultra mehkimi površinskimi lastnostmi, ki izhajajo iz potencialno biomimetičnih zasnov, ki jih navdihuje površina roženice očesa.Ta biomaterial je bil razvit s cepljenjem razvejane, navzkrižno povezane polimerne plasti poli(2-metakriloiloksietilfosforilholina (MPC)) (PMPC) na silikonski hidrogel (SiHy) 15, zasnovan za medicinske pripomočke, ki temeljijo na.Ta postopek cepljenja ustvari plast na površini, ki je sestavljena iz zelo mehke in visoko elastične razvejane polimerne krtačne strukture.Naše prejšnje delo je potrdilo, da biomimetična struktura lehfilcona A CL zagotavlja vrhunske površinske lastnosti, kot so izboljšano preprečevanje vlaženja in obraščanja, povečana mazljivost ter zmanjšana oprijemljivost celic in bakterij15,16.Poleg tega uporaba in razvoj tega biomimetičnega materiala nakazujeta tudi nadaljnjo širitev na druge biomedicinske pripomočke.Zato je ključnega pomena opredeliti površinske lastnosti tega ultra-mehkega materiala in razumeti njegovo mehansko interakcijo z očesom, da bi ustvarili celovito bazo znanja za podporo prihodnjega razvoja in aplikacij.Večina komercialno dostopnih SiHy kontaktnih leč je sestavljenih iz homogene mešanice hidrofilnih in hidrofobnih polimerov, ki tvorijo enotno materialno strukturo17.Izvedenih je bilo več študij, da bi raziskali njihove mehanske lastnosti z uporabo tradicionalnih preskusnih metod stiskanja, natezanja in mikrovdolbine18,19,20,21.Vendar pa je zaradi nove biomimetične zasnove lehfilcon A CL edinstven heterogeni material, v katerem se mehanske lastnosti struktur razvejanih polimernih ščetk bistveno razlikujejo od lastnosti osnovnega substrata SiHy.Zato je zelo težko natančno količinsko opredeliti te lastnosti z uporabo običajnih metod in metod vdolbine.Obetavna metoda uporablja metodo testiranja nanoindentacije, ki se izvaja v mikroskopiji na atomsko silo (AFM), metodo, ki je bila uporabljena za določanje mehanskih lastnosti mehkih viskoelastičnih materialov, kot so biološke celice in tkiva, kot tudi mehki polimeri 22, 23, 24, 25. .,26,27,28,29,30.Pri AFM nanoindentaciji so osnove testiranja nanoindentacije združene z najnovejšim napredkom v tehnologiji AFM, da se zagotovi večja občutljivost merjenja in testiranje širokega nabora inherentno supermehkih materialov31,32,33,34,35,36.Poleg tega tehnologija ponuja druge pomembne prednosti z uporabo različnih geometrij.indenter in sonda ter možnost testiranja v različnih tekočih medijih.
AFM nanoindentacijo lahko pogojno razdelimo na tri glavne komponente: (1) oprema (senzorji, detektorji, sonde itd.);(2) merilne parametre (kot so sila, premik, hitrost, velikost rampe itd.);(3) Obdelava podatkov (popravek osnovne črte, ocena stične točke, prilagajanje podatkov, modeliranje itd.).Pomemben problem pri tej metodi je, da več študij v literaturi, ki uporabljajo nanoindentacijo AFM, poroča o zelo različnih kvantitativnih rezultatih za isto vrsto vzorca/celice/materiala37,38,39,40,41.Na primer, Lekka et al.Študirali in primerjali smo vpliv geometrije AFM sonde na izmerjeni Youngov modul vzorcev mehansko homogenega hidrogela in heterogenih celic.Poročajo, da so vrednosti modula močno odvisne od izbire konzole in oblike konice, z najvišjo vrednostjo za sondo v obliki piramide in najnižjo vrednostjo 42 za sferično sondo.Podobno Selhuber-Unkel et al.Pokazalo se je, kako hitrost indentorja, velikost indenterja in debelina vzorcev poliakrilamida (PAAM) vplivajo na Youngov modul, izmerjen z nanoindentacijo ACM43.Drug zapleten dejavnik je pomanjkanje standardnih preskusnih materialov z izjemno nizkim modulom in brezplačnih preskusnih postopkov.Zaradi tega je zelo težko zanesljivo dobiti točne rezultate.Vendar pa je metoda zelo uporabna za relativne meritve in primerjalne ocene med podobnimi vrstami vzorcev, na primer z uporabo AFM nanoindentacije za razlikovanje normalnih celic od rakavih celic 44, 45.
Pri preskušanju mehkih materialov z AFM nanoindentacijo je splošno pravilo, da uporabite sondo z nizko vzmetno konstanto (k), ki se zelo ujema z modulom vzorca, in polkroglo/okroglo konico, tako da prva sonda ne prebode površine vzorca na prvi stik z mehkimi materiali.Pomembno je tudi, da je odklonski signal, ki ga ustvari sonda, dovolj močan, da ga zazna laserski detektorski sistem24,34,46,47.V primeru ultra mehkih heterogenih celic, tkiv in gelov je še en izziv premagati adhezivno silo med sondo in površino vzorca, da se zagotovijo ponovljive in zanesljive meritve48,49,50.Do nedavnega se je večina dela o nanoindentaciji AFM osredotočala na preučevanje mehanskega obnašanja bioloških celic, tkiv, gelov, hidrogelov in biomolekul z uporabo relativno velikih sferičnih sond, ki se običajno imenujejo koloidne sonde (CP)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Te konice imajo polmer od 1 do 50 µm in so običajno izdelane iz borosilikatnega stekla, polimetil metakrilata (PMMA), polistirena (PS), silicijevega dioksida (SiO2) in diamantnega kot ogljik (DLC).Čeprav je nanoindentacija CP-AFM pogosto prva izbira za karakterizacijo mehkih vzorcev, ima svoje težave in omejitve.Uporaba velikih, mikronskih sferičnih konic poveča celotno kontaktno površino konice z vzorcem in povzroči znatno izgubo prostorske ločljivosti.Pri mehkih, nehomogenih vzorcih, kjer se lahko mehanske lastnosti lokalnih elementov bistveno razlikujejo od povprečja na širšem območju, lahko vdolbina CP prikrije kakršno koli nehomogenost lastnosti v lokalnem merilu52.Koloidne sonde so običajno izdelane s pritrditvijo mikronskih koloidnih kroglic na konzole brez konic z uporabo epoksidnih lepil.Sam proizvodni proces je poln številnih težav in lahko privede do nedoslednosti v procesu kalibracije sonde.Poleg tega velikost in masa koloidnih delcev neposredno vplivata na glavne kalibracijske parametre konzole, kot so resonančna frekvenca, togost vzmeti in občutljivost na odklon 56,57,58.Tako običajno uporabljene metode za običajne AFM sonde, kot je temperaturna kalibracija, morda ne bodo zagotovile natančne kalibracije za CP, zato bodo morda potrebne druge metode za izvedbo teh popravkov57, 59, 60, 61. Tipični poskusi zarezovanja CP uporabljajo velika odstopanja konzole za preučevanje lastnosti mehkih vzorcev, kar ustvarja še en problem pri umerjanju nelinearnega obnašanja konzole pri relativno velikih odstopanjih62,63,64.Sodobne metode vrezovanja koloidne sonde običajno upoštevajo geometrijo konzole, ki se uporablja za kalibracijo sonde, vendar ne upoštevajo vpliva koloidnih delcev, kar ustvarja dodatno negotovost v točnosti metode38,61.Podobno so elastični moduli, izračunani s prileganjem kontaktnega modela, neposredno odvisni od geometrije vdolbinske sonde, neskladje med značilnostmi konice in površine vzorca pa lahko vodi do netočnosti 27, 65, 66, 67, 68. Nekatera nedavna dela Spencerja et al.Poudarjeni so dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri karakterizaciji mehkih polimernih čopičev z metodo nanoindentacije CP-AFM.Poročali so, da zadrževanje viskozne tekočine v polimernih ščetkah kot funkcija hitrosti povzroči povečanje obremenitve glave in s tem različne meritve lastnosti, odvisnih od hitrosti30,69,70,71.
V tej študiji smo karakterizirali površinski modul ultra mehkega visokoelastičnega materiala lehfilcon A CL z uporabo modificirane metode nanoindentacije AFM.Glede na lastnosti in novo strukturo tega materiala je obseg občutljivosti tradicionalne metode vdolbine očitno nezadosten za karakterizacijo modula tega izjemno mehkega materiala, zato je treba uporabiti metodo nanoindentacije AFM z večjo občutljivostjo in nižjo občutljivostjo.raven.Po pregledu pomanjkljivosti in težav obstoječih tehnik nanoindentiranja koloidne AFM sonde pokažemo, zakaj smo izbrali manjšo, po meri zasnovano AFM sondo za odpravo občutljivosti, hrupa v ozadju, natančne točke stika, merjenje modula hitrosti mehkih heterogenih materialov, kot je zadrževanje tekočine. odvisnost.in natančno kvantifikacijo.Poleg tega smo lahko natančno izmerili obliko in dimenzije konice vdolbine, kar nam je omogočilo uporabo modela prileganja stožca in krogle za določitev modula elastičnosti brez ocene kontaktne površine konice z materialom.Dve implicitni predpostavki, ki sta kvantificirani v tem delu, sta popolnoma elastične lastnosti materiala in od globine neodvisen modul vdolbine.S to metodo smo najprej preizkusili ultra mehke standarde z znanim modulom, da smo kvantificirali metodo, nato pa smo to metodo uporabili za karakterizacijo površin dveh različnih materialov kontaktnih leč.Pričakuje se, da bo ta metoda karakterizacije nanoindentacijskih površin AFM s povečano občutljivostjo uporabna za širok spekter biomimetičnih heterogenih ultramehkih materialov s potencialno uporabo v medicinskih napravah in biomedicinskih aplikacijah.
Kontaktne leče Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Teksas, ZDA) in njihovi substrati iz silikonskega hidrogela so bili izbrani za poskuse nanoindentacije.V poskusu je bil uporabljen posebej zasnovan bajonet za objektiv.Za namestitev leče za testiranje smo jo previdno položili na kupolasto stojalo, pri čemer smo pazili, da v notranjost ne pridejo zračni mehurčki, nato pa jo pritrdili z robovi.Luknja v vpenjalu na vrhu držala leče omogoča dostop do optičnega središča leče za poskuse z nanoindentacijo, medtem ko drži tekočino na mestu.Leče tako ostanejo popolnoma hidrirane.Kot testno raztopino smo uporabili 500 μl raztopine za pakiranje kontaktnih leč.Za preverjanje kvantitativnih rezultatov so bili komercialno dostopni neaktivirani poliakrilamidni (PAAM) hidrogeli pripravljeni iz sestavka poliakrilamid-ko-metilen-bisakrilamida (100 mm petrijevke Petrisoft, Matrigen, Irvine, CA, ZDA), z znanim modulom elastičnosti 1 kPa.Uporabite 4-5 kapljic (približno 125 µl) fiziološke raztopine s fosfatnim pufrom (PBS podjetja Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, ZDA) in 1 kapljico raztopine za kontaktne leče OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, ZDA).) na vmesniku AFM hidrogel-sonda.
Vzorci substratov Lehfilcon A CL in SiHy so bili vizualizirani s sistemom FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM), opremljenim z detektorjem Scanning Transmission Electron Microscope (STEM).Za pripravo vzorcev so bile leče najprej oprane z vodo in razrezane na zagozde v obliki pita.Za dosego diferencialnega kontrasta med hidrofilno in hidrofobno komponento vzorcev smo kot barvilo uporabili 0,10 % stabilizirano raztopino RuO4, v katero smo vzorce potopili za 30 minut.Barvanje lehfilcon A CL RuO4 je pomembno ne le za doseganje izboljšanega diferencialnega kontrasta, ampak tudi pomaga ohraniti strukturo razvejanih polimernih čopičev v njihovi prvotni obliki, ki so nato vidne na slikah STEM.Nato so jih sprali in dehidrirali v seriji mešanic etanola/vode z naraščajočo koncentracijo etanola.Vzorci so bili nato uliti z EMBed 812/Araldite epoksi, ki se je strdil čez noč pri 70 °C.Vzorčne bloke, pridobljene s polimerizacijo smole, smo razrezali z ultramikrotomom in nastale tanke reze vizualizirali s STEM detektorjem v načinu nizkega vakuuma pri pospeševalni napetosti 30 kV.Isti sistem SEM je bil uporabljen za podrobno karakterizacijo sonde PFQNM-LC-A-CAL AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, ZDA).SEM slike sonde AFM so bile pridobljene v tipičnem visokovakuumskem načinu s pospeševalno napetostjo 30 kV.Pridobite slike pod različnimi koti in povečavami, da zabeležite vse podrobnosti o obliki in velikosti konice sonde AFM.Vse zanimive dimenzije konic na slikah so bile izmerjene digitalno.
Mikroskop na atomsko silo Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, ZDA) z načinom »PeakForce QNM in Fluid« je bil uporabljen za vizualizacijo in nanoindentacijo vzorcev lehfilcon A CL, substrata SiHy in hidrogela PAAm.Za slikovne poskuse je bila uporabljena sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) z nominalnim polmerom konice 1 nm za zajemanje slik visoke ločljivosti vzorca pri hitrosti skeniranja 0,50 Hz.Vse slike so bile posnete v vodni raztopini.
Poskusi nanoindentacije AFM so bili izvedeni s sondo PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).Sonda AFM ima silikonsko konico na nitridni konzoli debeline 345 nm, dolžine 54 µm in širine 4,5 µm z resonančno frekvenco 45 kHz.Posebej je zasnovan za karakterizacijo in izvajanje kvantitativnih nanomehanskih meritev na mehkih bioloških vzorcih.Senzorji so tovarniško individualno umerjeni s predhodno umerjenimi nastavitvami vzmeti.Konstante vzmeti sond, uporabljenih v tej študiji, so bile v območju 0,05–0,1 N/m.Za natančno določitev oblike in velikosti konice smo sondo podrobno karakterizirali s SEM.Na sl.Na sliki 1a je prikazana skenirajoča elektronska mikrografija visoke ločljivosti z majhno povečavo sonde PFQNM-LC-A-CAL, ki zagotavlja celovit pogled na zasnovo sonde.Na sl.1b prikazuje povečan pogled na vrh konice sonde, ki zagotavlja informacije o obliki in velikosti konice.Na skrajnem koncu je igla polobla s premerom približno 140 nm (slika 1c).Pod tem se konica zoži v stožčasto obliko in doseže izmerjeno dolžino približno 500 nm.Zunaj zoženega območja je konica cilindrična in se konča s skupno dolžino konice 1,18 µm.To je glavni funkcionalni del konice sonde.Poleg tega je bila za testiranje kot koloidna sonda uporabljena tudi velika sferična polistirenska (PS) sonda (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, ZDA) s premerom konice 45 µm in vzmetno konstanto 2 N/m.s sondo PFQNM-LC-A-CAL 140 nm za primerjavo.
Poročali so, da se tekočina lahko ujame med sondo AFM in strukturo polimerne ščetke med nanoindentacijo, ki bo izvajala silo navzgor na sondo AFM, preden se dejansko dotakne površine69.Ta učinek viskoznega iztiskanja zaradi zadrževanja tekočine lahko spremeni navidezno kontaktno točko in tako vpliva na meritve površinskega modula.Za preučevanje vpliva geometrije sonde in hitrosti vdolbine na zadrževanje tekočine so bile krivulje sile vdolbine narisane za vzorce lehfilcon A CL z uporabo sonde s premerom 140 nm pri konstantnih stopnjah premikanja 1 µm/s in 2 µm/s.premer sonde 45 µm, fiksna nastavitev sile 6 nN dosežena pri 1 µm/s.Poskusi s sondo premera 140 nm so bili izvedeni pri hitrosti vdolbine 1 µm/s in nastavljeni sili 300 pN, izbrani za ustvarjanje kontaktnega tlaka v fiziološkem območju (1–8 kPa) zgornje veke.tlak 72. Mehke gotove vzorce hidrogela PAA s tlakom 1 kPa smo testirali na vtisno silo 50 pN pri hitrosti 1 μm/s s sondo premera 140 nm.
Ker je dolžina stožčastega dela konice sonde PFQNM-LC-A-CAL približno 500 nm, lahko za vsako globino vdolbine < 500 nm varno domnevamo, da bo geometrija sonde med vdolbino ostala zvesta svoji oblika stožca.Poleg tega se predpostavlja, da bo površina preskušanega materiala pokazala reverzibilen elastični odziv, kar bo potrjeno tudi v naslednjih razdelkih.Zato smo glede na obliko in velikost konice izbrali model prileganja stožca in krogle, ki so ga razvili Briscoe, Sebastian in Adams in je na voljo v programski opremi prodajalca, za obdelavo naših poskusov nanoindentacije AFM (NanoScope).Programska oprema za analizo podatkov o ločevanju, Bruker) 73. Model opisuje razmerje med silo in premikom F(δ) za stožec s sferično napako na vrhu.Na sl.Slika 2 prikazuje kontaktno geometrijo med interakcijo togega stožca s sferično konico, kjer je R polmer sferične konice, a je kontaktni polmer, b je kontaktni radij na koncu sferične konice, δ kontaktni polmer.globina vdolbine, θ je polovični kot stožca.Slika SEM te sonde jasno kaže, da se sferična konica s premerom 140 nm tangencialno združi v stožec, tako da je tukaj b definiran le skozi R, tj. b = R cos θ.Programska oprema, ki jo dobavi prodajalec, zagotavlja razmerje stožec-sfera za izračun vrednosti Youngovega modula (E) iz podatkov o ločitvi sile ob predpostavki a > b.Razmerje:
kjer je F vtična sila, E Youngov modul, ν Poissonovo razmerje.Kontaktni radij a je mogoče oceniti z uporabo:
Shema kontaktne geometrije togega stožca s sferično konico, stisnjenega v material kontaktne leče Lefilcon s površinsko plastjo razvejanih polimernih ščetk.
Če je a ≤ b, se razmerje reducira na enačbo za običajni sferični vdolbinec;
Verjamemo, da bo interakcija sonde za vdolbino z razvejano strukturo polimerne krtače PMPC povzročila, da bo kontaktni radij a večji od sferičnega kontaktnega radija b.Zato smo za vse kvantitativne meritve elastičnega modula, izvedene v tej raziskavi, uporabili odvisnost, dobljeno za primer a > b.
Ultramehki biomimetični materiali, preučevani v tej študiji, so bili celovito posneti z uporabo skenirajoče transmisijske elektronske mikroskopije (STEM) preseka vzorca in mikroskopije na atomsko silo (AFM) površine.Ta podrobna karakterizacija površine je bila izvedena kot razširitev našega predhodno objavljenega dela, v katerem smo ugotovili, da ima dinamično razvejana struktura polimerne ščetke površine lehfilcon A CL, modificirane s PMPC, podobne mehanske lastnosti kot nativno tkivo roženice 14.Zaradi tega površine kontaktnih leč imenujemo biomimetični materiali14.Na sl.3a, b prikazujeta prečne prereze razvejanih struktur polimernih ščetk PMPC na površini substrata lehfilcon A CL oziroma neobdelanega substrata SiHy.Površine obeh vzorcev smo dodatno analizirali z uporabo visokoločljivih AFM slik, ki so dodatno potrdile rezultate STEM analize (sl. 3c, d).Te slike skupaj dajejo približno dolžino strukture razvejane polimerne krtače PMPC pri 300–400 nm, kar je ključnega pomena za interpretacijo meritev nanoindentacije AFM.Druga ključna ugotovitev, ki izhaja iz slik, je, da je celotna površinska struktura biomimetičnega materiala CL morfološko drugačna od strukture substratnega materiala SiHy.Ta razlika v njihovi površinski morfologiji lahko postane očitna med njihovo mehansko interakcijo z vdolbino AFM sondo in nato v izmerjenih vrednostih modula.
Slike STEM v preseku (a) lehfilcon A CL in (b) substrata SiHy.Lestvica, 500 nm.Slike AFM površine substrata lehfilcon A CL (c) in osnovnega substrata SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirirani polimeri in strukture polimernih čopičev so sami po sebi mehki in so bili obsežno raziskani ter uporabljeni v različnih biomedicinskih aplikacijah74,75,76,77.Zato je pomembna uporaba metode AFM nanoindentacije, s katero je mogoče natančno in zanesljivo izmeriti njihove mehanske lastnosti.Toda hkrati edinstvene lastnosti teh ultra mehkih materialov, kot so izjemno nizek modul elastičnosti, visoka vsebnost tekočine in visoka elastičnost, pogosto otežujejo izbiro pravega materiala, oblike in oblike vdolbne sonde.velikost.To je pomembno, da indenter ne prebode mehke površine vzorca, kar bi povzročilo napake pri določanju točke stika s površino in območja stika.
Za to je bistveno celovito razumevanje morfologije ultra-mehkih biomimetičnih materialov (lehfilcon A CL).Informacije o velikosti in strukturi razvejanih polimernih ščetk, pridobljene z metodo slikanja, zagotavljajo osnovo za mehansko karakterizacijo površine z uporabo tehnik AFM nanoindentiranja.Namesto sferičnih koloidnih sond mikronske velikosti smo izbrali sondo iz silicijevega nitrida PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) s premerom konice 140 nm, posebej zasnovano za kvantitativno kartiranje mehanskih lastnosti bioloških vzorcev 78, 79, 80. , 81, 82, 83, 84 Razlog za uporabo razmeroma ostrih sond v primerjavi z običajnimi koloidnimi sondami je mogoče razložiti s strukturnimi značilnostmi materiala.Če primerjamo velikost konice sonde (~140 nm) z razvejanimi polimernimi ščetkami na površini CL lehfilcon A, prikazano na sliki 3a, lahko sklepamo, da je konica dovolj velika, da pride v neposreden stik s temi strukturami ščetk, kar zmanjša možnost, da bi konica predrla vanje.Za ponazoritev te točke je na sliki 4 STEM slika lehfilcon A CL in vdolbena konica sonde AFM (narisano v merilu).
Shema, ki prikazuje STEM sliko lehfilcon A CL in ACM indentacijske sonde (narisano v merilu).
Poleg tega je velikost konice 140 nm dovolj majhna, da se izogne ​​tveganju kakršnih koli učinkov lepljivega iztiskanja, o katerih so prej poročali za polimerne ščetke, proizvedene z metodo nanoindentiranja CP-AFM 69,71.Predvidevamo, da zaradi posebne stožčasto-sferične oblike in relativno majhne velikosti te AFM konice (slika 1) narava krivulje sile, ki jo ustvari lehfilcon A CL nanoindentacija, ne bo odvisna od hitrosti vdolbine ali hitrosti nalaganja/razkladanja .Zato nanj ne vplivajo poroelastični učinki.Za preizkus te hipoteze so bili vzorci lehfilcon A CL zamaknjeni pri fiksni največji sili z uporabo sonde PFQNM-LC-A-CAL, vendar pri dveh različnih hitrostih, dobljene krivulje natezne in uvlečne sile pa so bile uporabljene za prikaz sile (nN) v ločitvi (µm) je prikazano na sliki 5a.Jasno je, da se krivulje sile med obremenitvijo in razbremenitvijo popolnoma prekrivajo in ni jasnih dokazov, da se strižna sila pri ničelni globini vdolbine povečuje s hitrostjo vdolbine na sliki, kar kaže na to, da so bili posamezni elementi krtače označeni brez poroelastičnega učinka.Nasprotno pa so učinki zadrževanja tekočine (učinki viskoznega iztiskanja in poroelastičnosti) očitni za sondo AFM s premerom 45 µm pri enaki hitrosti vdolbine in so poudarjeni s histerezo med krivuljama raztezanja in umika, kot je prikazano na sliki 5b.Ti rezultati podpirajo hipotezo in kažejo, da so sonde s premerom 140 nm dobra izbira za karakterizacijo tako mehkih površin.
lehfilcon A CL krivulje sile vdolbine z uporabo ACM;(a) z uporabo sonde s premerom 140 nm pri dveh stopnjah obremenitve, ki dokazuje odsotnost poroelastičnega učinka med vdolbino površine;(b) z uporabo sond s premerom 45 µm in 140 nm.s prikazujejo učinke viskozne ekstruzije in poroelastičnosti za velike sonde v primerjavi z manjšimi sondami.
Za karakterizacijo ultramehkih površin morajo imeti metode AFM nanoindentacije najboljšo sondo za preučevanje lastnosti preučevanega materiala.Poleg oblike in velikosti konice igrajo pomembno vlogo pri določanju natančnosti in zanesljivosti nanoindentiranja občutljivost detektorskega sistema AFM, občutljivost na odklon konice v testnem okolju in togost konzole.meritve.Za naš sistem AFM je meja zaznavanja položajno občutljivega detektorja (PSD) približno 0,5 mV in temelji na predhodno kalibrirani stopnji vzmeti in izračunani občutljivosti na deformacijo tekočine sonde PFQNM-LC-A-CAL, ki ustreza teoretična občutljivost na obremenitev.je manj kot 0,1 pN.Zato ta metoda omogoča merjenje najmanjše sile vdolbine ≤ 0,1 pN brez kakršne koli periferne komponente šuma.Vendar pa je skoraj nemogoče, da bi sistem AFM zmanjšal periferni hrup na to raven zaradi dejavnikov, kot so mehanske vibracije in dinamika tekočin.Ti dejavniki omejujejo splošno občutljivost metode nanoindentacije AFM in povzročijo tudi signal hrupa v ozadju približno ≤ 10 pN.Za karakterizacijo površine so bili vzorci substrata lehfilcon A CL in SiHy vrezani pod popolnoma hidriranimi pogoji z uporabo 140 nm sonde za karakterizacijo SEM, nastale krivulje sile pa so bile superponirane med silo (pN) in tlakom.Graf ločevanja (µm) je prikazan na sliki 6a.V primerjavi z osnovnim substratom SiHy krivulja sile lehfilcon A CL jasno kaže prehodno fazo, ki se začne na točki stika z viličasto polimerno krtačo in konča z ostro spremembo naklona, ​​ki označuje stik konice s spodnjim materialom.Ta prehodni del krivulje sile poudarja resnično elastično obnašanje razvejane polimerne krtače na površini, kar dokazuje krivulja stiskanja, ki natančno sledi krivulji napetosti, in kontrast v mehanskih lastnostih med strukturo krtače in obsežnim materialom SiHy.Če primerjamo lefilcon.Ločitev povprečne dolžine razvejane polimerne krtače na STEM sliki PCS (slika 3a) in njene krivulje sile vzdolž abscise na sliki 3a.Slika 6a kaže, da je metoda sposobna zaznati konico in razvejan polimer, ki doseže sam vrh površine.Stik med strukturami ščetk.Poleg tega tesno prekrivanje krivulj sile ne kaže na učinek zadrževanja tekočine.V tem primeru med iglo in površino vzorca ni prav nobenega oprijema.Najvišji odseki krivulj sile za oba vzorca se prekrivajo, kar odraža podobnost mehanskih lastnosti substratnih materialov.
(a) Krivulje sile nanoindentacije AFM za substrate lehfilcon A CL in substrate SiHy, (b) krivulje sile, ki prikazujejo oceno kontaktne točke z uporabo metode praga šuma ozadja.
Da bi preučili natančnejše podrobnosti krivulje sile, je krivulja napetosti vzorca lehfilcon A CL ponovno narisana na sliki 6b z največjo silo 50 pN vzdolž osi y.Ta graf prikazuje pomembne informacije o izvirnem hrupu v ozadju.Šum je v območju ±10 pN, kar se uporablja za natančno določitev kontaktne točke in izračun globine vdolbine.Kot je navedeno v literaturi, je identifikacija kontaktnih točk ključnega pomena za natančno oceno lastnosti materiala, kot je modul85.Pristop, ki vključuje samodejno obdelavo podatkov krivulje sile, je pokazal izboljšano ujemanje med prilagajanjem podatkov in kvantitativnimi meritvami za mehke materiale86.V tem delu je naša izbira stičnih točk relativno preprosta in objektivna, vendar ima svoje omejitve.Naš konzervativni pristop k določanju stične točke lahko povzroči nekoliko precenjene vrednosti modula za manjše globine vdolbine (< 100 nm).Uporaba zaznavanja dotičnih točk na podlagi algoritmov in avtomatizirane obdelave podatkov bi lahko bila nadaljevanje tega dela v prihodnosti za nadaljnje izboljšanje naše metode.Tako za intrinzični hrup v ozadju reda ±10 pN kontaktno točko definiramo kot prvo podatkovno točko na osi x na sliki 6b z vrednostjo ≥10 pN.Nato v skladu s pragom hrupa 10 pN navpična črta na ravni ~ 0, 27 µm označuje točko stika s površino, po kateri se krivulja raztezanja nadaljuje, dokler substrat ne doseže globine vdolbine ~ 270 nm.Zanimivo je, da je glede na velikost razvejanih polimernih ščetk (300–400 nm), izmerjenih z metodo slikanja, globina vdolbine vzorca CL lehfilcon A, opazovana z metodo praga šuma ozadja, približno 270 nm, kar je zelo blizu meritev velikosti s STEM.Ti rezultati nadalje potrjujejo združljivost in uporabnost oblike in velikosti konice sonde AFM za vdolbino te zelo mehke in zelo elastične razvejane polimerne krtačne strukture.Ti podatki zagotavljajo tudi trdne dokaze v podporo naši metodi uporabe hrupa v ozadju kot praga za natančno določanje kontaktnih točk.Zato morajo biti vsi kvantitativni rezultati, dobljeni z matematičnim modeliranjem in prilagajanjem krivulje sile, razmeroma natančni.
Kvantitativne meritve z metodami nanoindentacije AFM so popolnoma odvisne od matematičnih modelov, uporabljenih za izbor podatkov in kasnejšo analizo.Zato je pomembno upoštevati vse dejavnike, povezane z izbiro indenterja, lastnosti materiala in mehaniko njihovega medsebojnega delovanja, preden se odločimo za določen model.V tem primeru je bila geometrija konice natančno označena z mikrografi SEM (slika 1) in na podlagi rezultatov je nanoindentna sonda AFM s premerom 140 nm s trdim stožcem in sferično geometrijo konice dobra izbira za karakterizacijo vzorcev lehfilcon A CL79 .Drug pomemben dejavnik, ki ga je treba natančno oceniti, je elastičnost preskušanega polimernega materiala.Čeprav začetni podatki nanoindentiranja (sl. 5a in 6a) jasno orisujejo značilnosti prekrivanja nateznih in kompresijskih krivulj, tj. popolno elastično okrevanje materiala, je izjemno pomembno potrditi čisto elastično naravo stikov. .V ta namen sta bili izvedeni dve zaporedni vdolbini na istem mestu na površini vzorca lehfilcon A CL s hitrostjo vdolbine 1 µm/s v pogojih popolne hidratacije.Dobljeni podatki krivulje sile so prikazani na sl.7 in, kot je bilo pričakovano, sta krivulji raztezanja in stiskanja obeh odtisov skoraj enaki, kar poudarja visoko elastičnost strukture razvejanih polimernih čopičev.
Dve krivulji sile vdolbine na istem mestu na površini lehfilcon A CL kažeta idealno elastičnost površine leče.
Na podlagi informacij, pridobljenih iz SEM in STEM slik konice sonde oziroma površine lehfilcon A CL, je model stožčaste krogle razumen matematični prikaz interakcije med konico sonde AFM in preskušanim mehkim polimernim materialom.Poleg tega za ta model stožčaste krogle temeljne predpostavke o elastičnih lastnostih vtisnjenega materiala veljajo za ta novi biomimetični material in se uporabljajo za kvantificiranje modula elastičnosti.
Po celoviti oceni metode nanoindentacije AFM in njenih komponent, vključno z lastnostmi indentacijske sonde (oblika, velikost in togost vzmeti), občutljivostjo (šum ozadja in ocena kontaktne točke) in modeli prilagajanja podatkov (meritve kvantitativnega modula), je bila metoda rabljeno.karakterizirajo komercialno dostopne ultra-mehke vzorce za preverjanje kvantitativnih rezultatov.Komercialni poliakrilamidni (PAAM) hidrogel z modulom elastičnosti 1 kPa je bil testiran v hidratiranih pogojih z uporabo 140 nm sonde.Podrobnosti o testiranju modula in izračunih so na voljo v Dodatnih informacijah.Rezultati so pokazali, da je bil povprečni izmerjeni modul 0,92 kPa, %RSD in odstotek (%) odstopanja od znanega modula pa manj kot 10 %.Ti rezultati potrjujejo točnost in ponovljivost metode nanoindentacije AFM, uporabljene v tem delu za merjenje modulov ultramehkih materialov.Površine vzorcev lehfilcon A CL in osnovnega substrata SiHy so bile nadalje karakterizirane z uporabo iste metode nanoindentacije AFM, da bi preučili navidezni kontaktni modul ultramehke površine kot funkcijo globine vdolbine.Krivulje ločevanja sile vdolbine so bile ustvarjene za tri vzorce vsake vrste (n = 3; ena vdolbina na vzorec) pri sili 300 pN, hitrosti 1 µm/s in popolni hidrataciji.Krivulja porazdelitve sile vdolbine je bila aproksimirana z uporabo modela stožca-sfere.Za pridobitev modula, ki je odvisen od globine vdolbine, je bil nastavljen 40 nm širok del krivulje sile pri vsakem koraku 20 nm, začenši s točko stika, in izmerjene vrednosti modula na vsakem koraku krivulje sile.Spin Cy et al.Podoben pristop je bil uporabljen za karakterizacijo gradienta modula polimernih ščetk iz poli(lauril metakrilata) (P12MA) z uporabo nanoindentacije koloidne AFM sonde in so skladni s podatki, ki uporabljajo Hertzov kontaktni model.Ta pristop zagotavlja graf navideznega kontaktnega modula (kPa) glede na globino vdolbine (nm), kot je prikazano na sliki 8, ki ponazarja navidezni kontaktni modul/globinski gradient.Izračunani modul elastičnosti vzorca CL lehfilcon A je v območju 2–3 kPa znotraj zgornjih 100 nm vzorca, nad tem pa začne naraščati z globino.Po drugi strani pa je pri preskušanju osnovnega substrata SiHy brez čopiču podobnega filma na površini največja globina vdolbine, dosežena pri sili 300 pN, manjša od 50 nm, vrednost modula, pridobljena iz podatkov, pa je približno 400 kPa , kar je primerljivo z vrednostmi Youngovega modula za razsute materiale.
Navidezni kontaktni modul (kPa) glede na globino vdolbine (nm) za substrate lehfilcon A CL in SiHy z uporabo metode nanoindentacije AFM z geometrijo stožčaste krogle za merjenje modula.
Najvišja površina nove biomimetične strukture razvejane polimerne ščetke ima izjemno nizek modul elastičnosti (2–3 kPa).To se bo ujemalo s prostim visečim koncem razcepljene polimerne krtače, kot je prikazano na sliki STEM.Čeprav obstaja nekaj dokazov o gradientu modula na zunanjem robu CL, je glavni substrat z visokim modulom bolj vpliven.Vendar pa je zgornjih 100 nm površine znotraj 20 % celotne dolžine razvejane polimerne krtače, zato je razumno domnevati, da so izmerjene vrednosti modula v tem območju globine vdolbine razmeroma natančne in ne močno odvisno od učinka spodnjega predmeta.
Zaradi edinstvene biomimetične zasnove kontaktnih leč lehfilcon A, sestavljenih iz razvejanih polimernih krtačastih struktur PMPC, cepljenih na površino substratov SiHy, je zelo težko zanesljivo označiti mehanske lastnosti njihovih površinskih struktur z uporabo tradicionalnih merilnih metod.Tukaj predstavljamo napredno metodo nanoindentacije AFM za natančno karakterizacijo ultra-mehkih materialov, kot je lefilcon A z visoko vsebnostjo vode in izjemno visoko elastičnostjo.Ta metoda temelji na uporabi sonde AFM, katere velikost in geometrija konice sta skrbno izbrani, da ustrezata strukturnim dimenzijam ultra mehkih površinskih značilnosti, ki jih je treba odtisniti.Ta kombinacija dimenzij med sondo in strukturo zagotavlja povečano občutljivost, kar nam omogoča merjenje nizkega modula in inherentnih elastičnih lastnosti elementov razvejane polimerne ščetke, ne glede na poroelastične učinke.Rezultati so pokazali, da imajo edinstvene razvejane polimerne ščetke PMPC, ki so značilne za površino leče, izjemno nizek modul elastičnosti (do 2 kPa) in zelo visoko elastičnost (skoraj 100 %) pri testiranju v vodnem okolju.Rezultati nanoindentacije AFM so nam omogočili tudi karakterizacijo navideznega kontaktnega modula/globinskega gradienta (30 kPa/200 nm) površine biomimetične leče.Ta gradient je lahko posledica modulske razlike med razvejanimi polimernimi ščetkami in substratom SiHy ali razvejane strukture/gostote polimernih ščetk ali njihove kombinacije.Vendar so potrebne nadaljnje poglobljene študije, da bi v celoti razumeli razmerje med strukturo in lastnostmi, zlasti učinek razvejanosti krtač na mehanske lastnosti.Podobne meritve lahko pomagajo opredeliti mehanske lastnosti površine drugih ultra mehkih materialov in medicinskih pripomočkov.
Podatkovni nizi, ustvarjeni in/ali analizirani med trenutno študijo, so na voljo pri zadevnih avtorjih na razumno zahtevo.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. in Haugen, HJ Biološke reakcije na fizikalne in kemijske lastnosti površin biomaterialov.Kemični.družbe.Ed.49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM in Liu, X. Izboljšanje biomaterialov človeškega izvora za tkivno inženirstvo.programiranje.polimer.znanost.53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al.Zasnova, klinična izvedba in imunski odziv biomaterialov v regenerativni medicini.National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK in Farr GM Izboljšana metoda za določanje trdote in modula elastičnosti z uporabo poskusov vdolbine z meritvami obremenitve in premika.J. Alma mater.rezervoar za shranjevanje.7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Zgodovinski izvori testiranja trdote vdolbin.alma mater.znanost.tehnologije.28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Meritve trdote vdolbine na makro-, mikro- in nanoskali: kritični pregled.pleme.Wright.65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD in Clapperich, SM Napake pri zaznavanju površine vodijo do precenjevanja modula pri nanoindentaciji mehkih materialov.J. Meha.Vedenje.Biomedicinska znanost.alma mater.2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR in Yahya M.Yu.Vrednotenje metode nanoindentiranja za določanje mehanskih karakteristik heterogenih nanokompozitov z uporabo eksperimentalnih in računskih metod.znanost.Hiša 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, in Owart, TS Mehanska karakterizacija mehkih viskoelastičnih gelov z vdolbino in optimizacijsko inverzno analizo končnih elementov.J. Meha.Vedenje.Biomedicinska znanost.alma mater.2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J in Chaneler D. Optimizacija določanja viskoelastičnosti z uporabo združljivih merilnih sistemov.Mehka snov 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. in Pellillo, E. Nanoindentacija polimernih površin.J. Fizika.D. Prijavite se za fiziko.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. in Van Vliet KJ Karakterizacija viskoelastičnih mehanskih lastnosti visoko elastičnih polimerov in bioloških tkiv z uporabo udarne vdolbine.Journal of Biomaterials.71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Vrednotenje modula elastičnosti in adhezije mehkih materialov z uporabo razširjene metode Borodich-Galanov (BG) in globokega vdolbina.krzno.alma mater.129, 198–213 (2019).
Shi, X. et al.Nanometrska morfologija in mehanske lastnosti biomimetičnih polimernih površin silikonskih hidrogelnih kontaktnih leč.Langmuir 37, 13961–13967 (2021).